[프로토콜]플라스미드 분리법 (Isolation of plasmids)

*질문, 필요하신 정보 댓글이나 방명록에 남기시면 함께 고민해 보겠습니다.

목적: Bacterial cell에서 plasmid DNA를 분리한다.

Plasmid는 일반적으로 원형 (circular) 때때로 선형 (linear) dsDNA의 형태를 갖는다. 비필수 유전정보 (non-essential genes)에 해당하며 유전공학에서 운반체 (vectors)로 여겨진다. 형질전환 (transformation)을 통해 Bacterial cell에 도입 될수있다.

기능에 따라
1. fertility F-plasmids
2. resistance R-plasmids
3. Col plasmids
4. degradative plasmids
5. virulence plasmids

Plasmid DNA 추출 방법을 살펴보면,
1. Bacteria 에서 plasmid DNA를 추출 하기 위해 Solution 1, Solution 2. Solution 3을 아래와 같이 준비한다.
  Solution 1 (Lysis buffer 1), 50 mM Tris pH 8.0 with HCl, 10mM EDTA
-Tris Base 6.06 g
-EDTA*2H20 3.72 g을 800 mL milli-Q에 녹이고 pH8.0를 맞춘다. (with HCl)
-milli-Q를 이용하여 1L를 맞추고 멸균(autoclave)하여 4'C에 보관한다.
  Solution 2 (Lysis buffer 2), 200mM NaOH, 1%SDS
-NaOH 8.0g을 950 mL milli-Q에 녹이고 20% SDS용액 50mL을 넣는다. (사용전에 제조하여 사용한다)
  Solution 3 (Lysis buffer 3), 3.0 M KOAc, pH5.5
-potassium acetate 294.5 g을 500 mL milli-Q에 넣어 녹이고 glacial acetic acid 를 이용하여 pH5.5를 맞춘다.
-milli-Q를 이용하여 1L를 맞추고 멸균(autoclave)하여 4'C에 보관한다.
3. Bacterial cell을 준비한다.
4. Bacterial cell 펠렛을 원심분리기 (6000 rpm, 5분, 실온)를 이용하여 모은다.
5. 상등액을 제거하고 펠렛에 600 uL 멸균된 TE buffer를 넣어 재부유한 뒤 원심분리한다 (6000 rpm, 5분, 실온).
6. 상등액을 제거하고 펠렛에 1 mL의 Solution 1 (Ice-cold)을 넣고 파이펫팅으로 재부유한다.
7. 200 uL의 solution 2을 추가하고  조심스럽게 섞어준다. (vortexting X)
8. 1.5 mL의 solution 3 (Ice-cold)을 추가하여 세포를 파쇄한다. (vortexting X)
9. 흰색의 침전물이 생기는 것이 확인되면 12,000 rpm, 30분, 4'C로 원심분리한다.
10. 상등액을 새로운 Tube에 옮겨 담는다.
11. 상등액 볼륨의 2.5배 isoproanol 넣어 완전히 섞는다. (vortexting X)
12. 12,000 rpm, 30분, 4'C로 원심분리한다.
13. 상등액을 제거하고 펠렛을 모은다.
14. 펠렛을 70% Ethanol (Ice-cold)로 행구고 Ethanol이 완전히 증발하도록 10분 이상 말린다.
15. 펠렛에 50 uL TE buffer를 넣어 용해시킨다.
16. RNA contamination을 막기위해 2 uL RNase (10 mg/mL)을 넣고 20분간 실온에서 반응시킨다.
17. 추출한 Plasmid를 바로사용 하지 않는다면 -20'C에 보관한다.

*Vortexing을 하지 않고 조심스럽게 섞는 (Inversion) 이유.
-Plasmid DNA는 물리적인 힘(mechanical stress, shearing forces))에 매우 민감하기 때문

*genomic DNA와 Plasmid DNA가 분리 되는 이유
Bacteria의 genomic DNA는 과량(huge amount), 과중(high molecular weight)으로 원심분리 속도를 높여 Plasmid DNA와 분리가능함.

Troubleshootings
- Low yield of plasmid DNA

- RNA contamination

- Insoluble pellet after DNA precipitation

- Poor performance in down-stream applications with the plasmid DNA

- Contamination with Baterial chromosomal DNA

- Smear in gel/degraded plasmid