[미생물]실험에 필요한 기본 지식_접종, 균주보존

*질문, 필요하신 정보 댓글이나 방명록에 남기시면 함께 고민해 보겠습니다.

1.미생물을 접종할 때 사용하는 기분 기구는 '백금이'나 '백금선'

1.1. 백금선 (Platinum needle 또는 transfer needle)

주로 고체배지에서 균을 채취하거나, 천자 배양할 때 접종에 사용

1.2. 백금이 (Platinum loop 또는transfer loop)

백금이의 크기와 모양은 배지의 점도와 필요에 따라 조절해 사용

액체배지, 고체배지에 균을 채취할 때 사용

1.3. 삼각 유리봉

평판 배지에 균체를 골고루 얇게 접종하고자 할 때 사용

2. 균주의 보존

2.1. 균주의 의미

균주는 한 종류의 균을 순수배양하여 분리한 균 

2.2. 보존방법

병원미생물의 경우, 성상의 변화 없이 장기간 보존할 수 있는 방법으로 동결 건조 보존과 동결 보존이 이용됨

2.2.1. 동결건조 보존

대부분의 세균, 바이러스에 적당. 효모, 곰팡이의 일부에도 적용

분산매로는 탈지유 (15~20%) 혈청, 당용액 등이 사용

분산시킬 균의 농도는 10^9~10^10 cells/mL

드라이아이스-알코올 액에 넣어 예비 동결시킨 후 동결 건조기에 연결하여 진공 하에서 건조

건조가 끝나면 앰플의 목 부분을 가열하여 용봉

동결 건조된 균주는 냉암소에 보존하는 것이 좋음

균주를 부활 시킬 때에는 앰플을 무균적으로 절단한 후 균체에 액체배지를 넣어 현탁시키고, 현탁액을 배지에 옮겨 배양

2.2.2. 동결 보존

원충, 동물 세포 등 동결 건조가 불가능한 것도 동결 보존이 가능한 경우가 많음

동결 보존 온도는 낮을 수록 좋으며, 장기 보존의 경우 적어도 -70'C 이하의 온도

-80'C 전후의 냉동고 (Deep freezer)가 보통 사용

액체질소탱크 (가스상 -170'C, 액상 -190'C)

분산매에 10^9~10^10 cells/mL의 높은 농도가 되게 현탁

부유액을 소형시험관에 1~2 mL씩 분주,마개를 한 후 동결

동결속도는 대부분의 세균에서 급속 동결이 좋음

보조제로 글리세린 (10~20%), DMSO (5~10%)를 첨가한 증식용 배양액에 균주를 부유한 경우에는 서서히 동결해야함

보존 중인 균주를 부활 시킬 때에는 빨리 융해 (37'C, 45'C의 온탕에 넣어 가볍게 흔들면서 융해)

2.2.3. 보존기관

균주의 보존과 분양을 업무로 하는 기관

국제적인 균주 보존 기관 미국의 American Type Culture collection ( ATCC), 영국의 National collection of Type Cultures (NCTC), 네덜란드의 Centraalbureau voor Schimmelcutuer (CBS), 

우리나라에는 Korean Collection for type cultures (KCTC)

3. 호기성 균 및 혐기성균의 배양

미생물의 종류에 따라 산소 요구도는 다름

호기성균 (aerobes), 산소가 있어야만 성장이 가능한 균

혐기성균 (anaerobes), 산소가 없어야만 증식하는 균

산소가 필요할 경우 진탕배양 (shaking incubator)을 이용하여 액체 배지 내로 공기의 주입을 증가 시키기 위함

혐기성균을 배양하기 위해 무산소 상태를 유지 필요

배지에 환원력이 강한 물질인 시스테인 (cystine), 티오글리콜레이트 (thioglycollate), 비타민 C(vitamin C) 등을 넣음

동물의 장기 조직으로 만든 배지는 환원력이 강하여 혐기성 배지가 될 수 있음

배양 공간의 산소를 없애려면, 배양 공간에 있는 산소를 제거하고 대신 N2, CO2로 치환하는 방법

혐기배양기 속에 가스팩을 넣거나, 산소 대신 가스를 치환하는 장치 이용

*가스팩에 있는 화학물질에 물을 첨가하여 수소와 이산화 탄소를 발생 -> 수소와 산소가 결합하여 물을 형성

4. 세균수의 측정

평판 계수법은 가장 보편적으로 쓰이는 방법, 생균수 측정법 (viable count)

평판배지 상에 형성된 콜로니 수는 시료 내에 포함되어 있는 콜로니 형성이 가능한 살아있는 세균의 숫자로 볼수 있음

직접 현미경 계수법

알려진 넓이의 현미경 시야에 보이는 균수를 세는 방법

표본수가 많은 경우에는 배양액의 탁도 (turbidity, optical density)를 측정하는 것이 간편

세균의 농도가 증가함에 따라 탁도 (흡광도)도 비례하여 증가

탁도를 실제의 세균수로 계싼하기 위해서는 평판 배양법을 병행해서, 탁도와 세균수와의 상관관계를 구해야 함