[프로토콜] 박테리아 파쇄방법(용출액) Preparation of Bacterial Lysates

*질문, 필요하신 정보 댓글이나 방명록에 남기시면 함께 고민해 보겠습니다.

박테리아 세포를 파쇄하여 세포 용출액(Lysates)를 분리하는 방법에 대해 알아보자.

박테리아세포를 파쇄하는 대표적인 방법은 아래와 같다.

1. Boiling Lysis (끓이는 방법)
2. Sonication (초음파 파쇄기 이용)
3. Lysozyme Digestion (박테리아 용해효소 이용)
4. Repeated Freezing and Thawing (열리고 녹이는 것을 반복는 방법)
5. Homogenisation (Homogeniser를 이용한 균질화)

각 방법에 대해 자세히 알아보자.

 Boiling Lysis (끓이는 방법)
1. Bacterial cell을 준비한다. 
2. Bacterial cell 1mL을 튜브 (e-Tube)에 넣고 원심분리기를 이용하여 6000rpm, 5min, RT(room temperature) 원심분리한다.
3. 상등액 (superantant)를 제거하고, 멸균된 milli-Q Water 200uL 이용하여 재부유 (resuspend)한다.
4. 100'C의 Water bath 또는 끓는 물을 용기에 넣어 준비한다.
5. Bacterial Cell이 들어있는 튜브를 끓는 물에 넣고 10분간 반응시킨다.
6. 10분간 끓는 물에서 반응이 끝나면 얼음(ice)에 넣어 5분간 반응시킨다.
7. 반응이 끝나면 원심분리기를 이용하여 10000 rpm, 5min, 4'C로 원심분리한다.
8. 상등액 (Suspernatant)를 새로운 튜브로 옮기고 4'C에 보관하여 이후 필요한 실험에 사용한다.

Sonication (초음파 파쇄기 이용)
1. Bacterial cell을 준비한다. 
2. Bacterial cell 1mL을 튜브 (e-Tube)에 넣고 원심분리기를 이용하여 6000rpm, 5min, 4'C (room temperature) 원심분리한다.
3. 상등액 (supernatant)를 제거하고 필요시 배양액을 추가하여 다시 원심분리기를 이용하여 6000rpm, 5min, 4'C (room temperature) 원심분리한다.
4. 상등액을 제거하고 멸균된 milli-Q Water 600uL 넣고 진탕기를 이용하여 재부유 (resuspend)한다.
5. 원심분리기를 이용하여 6000rpm, 5min, 4'C (room temperature) 원심분리하고 상등액을 제거한 뒤 1X TE buffer 600uL을 넣고 탕기를 이용하여 재부유 (resuspend)한다.
6. 시료 튜브를 ice에 넣고 초음파파쇄기(sonicator)를 이용하여 2min, 22um amplitude, short pulses (5-10s) pauses (10-30s)로 이용하여 파쇄한다. 
*초음파파쇄기의 작동 조건(세기, pulse시간, pauses시간)은 사용하는 기기의 메뉴얼을 참고하여 적절한 조건을 설정하여야 한다.
*초음파파쇄시 열이 발생할수 있으므로 시료를 ice에 넣고 파쇄할 필요가 있다.
7. 원심분리기를 이용하여 10000rpm, 5min 원심분리하고 상등액을 새로운 튜브에 옮겨 담는다.
8. 상등액 튜브를 -20'C에 보관하고 필요한 실험에 사용한다.

Lysozyme Digestion (박테리아 용해효소 이용)
1. Bacterial cell을 준비한다. 
2. Lysozyme을 TE Buffer에 10 mg/mL 농도로 천천히 4'C에서 (Ice) 녹인다.
3. 준비한 Lysozyme stock (10 mg/mL) 100  uL을 Bacterial culture 용액에 넣어 최종 1mg/mL의 농도로 맞춘다.
4. 30'C Incubator에 넣어 천천히 교반하면서 30분에서 1시간 반응시킨다.
5. 반응이 완료되면 Centrifuge 10,000 rpm, 10분, 4'C로 원심분리하고 상등액을 분리하여 새로운 용기(튜브)에 옮긴다.
6. 분리된 용출액을 바로 사용하지 않는다면, -20'C에 보관하여 사용한다.

Repeated Freezing and Thawing (열리고 녹이는 것을 반복는 방법)
1. Bacterial cell을 준비한다.
2. Bacterial cell 배양액 1 mL을 ep-tube에 넣고 6,000 rpm, 5분, 4'C로 원심분리하고 상등액을 제고하고 펠렛을 남긴다.
3. 동일한 ep-Tube에 Bacterial cell 배양액 1 mL을 다시 넣어  6,000 rpm, 5분, 4'C로 원심분리하고 상등액을 제고하고 펠렛을 남기는 과정을 반복한다. (충분한 양의 펠렛을 얻을때 까지)
4. 충분한양의 펠렛에 200 ul 멸균 (sterilised) milli-Q를 넣어 재부유(resuspension)한다.
5. 액체 질소에 펠렛부유액이 담긴 tube를 3분간 넣어 얼린다.
6. 뜨거운 물 (80-90 'C)에  얼어있는 펠렛 부유액이 담긴 tube를 넣어 3분간 녹인다.
7. 5번, 6번 단계를 3회(필요시 더 충분히) 반복하여 얼리고 녹인다. 단계를 반복할때  tube내의 펠렛 부유액을 잘 섞어준다.
8. 10,000 rpm, 5분, 4'C로 펠렛 부유액 tube를 원심분리한다.
9. micro-pipette을 이용하여 상등액을 새 tube에 옮기고 펠렛은 버린다.
10. 분리된 용출액을 바로 사용하지 않는다면, -20'C에 보관하여 사용한다.

Homogenisation (Homogeniser를 이용한 균질화)
1. Bacterial cell을 준비한다.
2. Bacterial cell 배양액 1 mL을 ep-tube에 넣고 6,000 rpm, 5분, 4'C로 원심분리하고 상등액을 제고하고 펠렛을 남긴다.
3. 동일한 ep-Tube에 Bacterial cell 배양액 1 mL을 다시 넣어  6,000 rpm, 5분, 4'C로 원심분리하고 상등액을 제고하고 펠렛을 남기는 과정을 반복한다. (충분한 양의 펠렛을 얻을때 까지)
4. 충분한양의 펠렛에 200 ul 멸균 (sterilised) TE buffer를 넣어 재부유(resuspension)한다.
5. cooling water 공급을 확인하고 homogeniser를 이용하여 Bacterial cell 배양액 세포를 파쇄한다. *자세한 homogeniser 사용 방법은 기기메뉴얼에 따른다.
6. 균질화(homogenate)된 (파쇄된) 세포를 10,000 rpm, 10분, 4'C로 원심분리하여 상등액을 새로운 Tube에 옮긴다.
7. 분리된 용출액을 바로 사용하지 않는다면, -20'C에 보관하여 사용한다.

*추출한 DNA의 정량(quantity) 및 정성(quality) 을 확인하기 위해
agarose gel electrophoresis 또는 ultra-violet (UV)- visible spectrophotometer를 사용할 수 있다.

Optical density 260nm (OD260)에서 1.0 은 아래와 같다.
1. dsDNA (double-stranded DNA) 50 ug/mL
2. ssDNA (single-stranded DNA) 33ug/mL
3. oligonucleotide 20~30ug/mL
4. RNA 40 ug/mL

Pure DNA OD 260/280 = 1.8
Pure RNA OD 260/280 = 2.0
OD 260/280 < 1.8, more protein contamination
 OD 260/280 > 1.8, more RNA contamination

Trobleshooting
Degraded DNA
 - 끓이는 중, Sonication 중 고온에 의한 경우
No yield
 -Cell lysis가 적절하지 않은 경우, Lysozyme (for Gram-negative), Lysostaphin (for Gram-positive) 두 엔자임 모두 최종 1 ug/mL농도