[단백질]단백질의 안정화

*질문, 필요하신 정보 댓글이나 방명록에 남기시면 함께 고민해 보겠습니다.

단백질을 보관 실험 할 때 단백질을 안정화 시킬 필요가 있다.

단백질 안정화의 중요성
  단백질은 특유의 구조를 지녀 DNA와 달리 활성을 보유
  단백질의 분리정제와 보존 과정에서 활성을 유지한 채 높은 회수율(yields)로 얻어내는 것이 대단히 중요

  회수율의 저하 (단백질이 갖는 원래 기능이 사라지거나(불활성화), 변성에 의해 녹지 않는 불용화, 용기의 표면 등에 붙어서 단백질 자체가 회수 되지 않는것 등이 원인)

  불활성화는 열, 변성제, 극단의 pH, 단백질 분해효소(protease)에 의한 분해 등이 주원인, 구조가 바뀌면서 발생
  단백질은 고차구조와 기능이 밀접하게 연결되어 있어 비교적 작은 환경변화에도 구조가 변화

  고차구조를 변화시키는 요인을 제거함, 필요한 여러 요소들을 첨가물

단백질의 구조
  입체구조를 유지하기 위한 주요한 힘
    시스테인 잔기 사이의 S-S 결합과 같은 공유결합
    정전기결합(이온결합)
    수소결합
    소수결합(소수성 상호작용)

    수소결합의 경우는 폴리펩타이드 주사슬의 C=O와 NH 사이, 주사슬과 옆사슬, 옆사슬과 옆사슬 간에 존재
 

방부제
Sodium azide (사용농도 0.05〜0.1% w/v)는 단백질용액의 방부제로 우수한 성질
*중금속과 반응하여 폭발성의 염을 형성하기 때문에 폐액 처리에 문제

Protease 저해제
  단백질을 분해하는 효소인 protease
  단백질 실험을 낮은 온도에서 수행하는 이유가 이 protease의 활성을 최소화하기 위해
  저해제로는 iodoacetic acid와 p-chloromercuribenzoic acid가 유명하나 단백질의 SH기에 변형을 주기 때문에 안정화 시약으로는 적절하지 않음

  일반적으로 
    benzamidine phenylmethne sulfonyl fluoride (PMSF로 serine protease inhibitor)
    ethylenediam inetetraacetic acid (EDTA로 금속 protease inhibitor)
펩타이드로 된 미생물유래 저해제(antipain, pepstatin, leupeptin, chymostatin등)

0.5 benzamidin·HCl
  Benzamidin·HCI·H2O (M.W. = 174.63) 8.73 g으로 증류수를 첨가하여 전체 100 mL가 되게 하며, 실온보존이 가능하고 사용농도는 0.5〜5mM

0.2M PMSF
  PMSF (M.W. = 174.2) 69.7 mg으로 2 mL의 DMSO에 녹이며, 사용 때 마다 제조해야 하고 사용농도는 0.1〜1 mM

0.2M EDTA
  EDTA·2Na·2H2O (M.W. = 372.24) 7.44 g으로 증류수를 첨가하여 전체 100 mL가 되게 하며, NaOH로 pH를 7 부근에 조절하여 실온보존이 가능하며, 사용농도는 1〜10 mM
*과량의 NaOH를 가하는 경우 pH가 강한 알칼리로 바뀌고 Na가 포화되어 EDTA의 금속 포집 효과가 사라진다.

Leupeptin 1 mg/mL
  Leupeptin (M.W. = 426.56)을 DMSO에 녹여 냉동보존하며, 사용농도는 1-10 μg/mL

Pepstatin A 1 mg/mL
Pepstatin A (M.W. = 685.90)를 DMSO에 녹여 냉동보존하며, 사용농도는 1~10 μg/mL


다수산기성 화합물 
  당(탄수화물)과 glycerol은 단백질의 열변성, 산성변성, 동결변성에 대하여 안정화 효과

  단백질은 동결 시 그 활성을 잃는 경우가 많으므로 이 다수산기성 화합물이 안정제로 널리 사용
  25〜50% (w/v) 글리세롤, 25 mM 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol) 600
  50% (w/v) glycerol 용액으로 -20°C에서 보존 
  폴리에틸렌 글리콜은 동결 시에는 안정화제의 역할을 하지만 용액상태에서는 안정성을 저하시키는 작용, 정제과정의 시료에는 이 화합물에 의해 점성

SH기 보호제와 산화방지제
  단백질의 활성에 중요한 역할을 하는 것이 –SH 잔기
  활성 발현에 직접 관여하고 SH기의 산화에 의해서도 불활성화
  S-S결합이 절단됨으로써 활성을 잃는 경우
  2-mercaptoethanol과 dithiothreitol (DTT)가 주로 사용
  SH기의 보호제로 사용되는 0.5M DTT는 1,4-dithiothreitol(M.W. = 154.24) 0.771 g으로 증류수를 넣어 최종 10 mL, 냉동보존 사용농도는 0.1〜2 mM