[단백질] 완충용액 선택

*질문, 필요하신 정보 댓글이나 방명록에 남기시면 함께 고민해 보겠습니다.

완충용액 

강산이나 강염기와 같은 외부의 높은 pH 변화에도 완충해 낼 수 있는 용액

요구하는 pH에 따른 완충용액의 선택

해리상수인 pKa값을 확인하여 결정하는 것이 중요

완충용액 선택

단백질 20개의 아미노산으로 구성

아미노산자체가 완충용액 (buffer solution)

완충용액의 정확한 제조는 단백질 연구에서 기본 중 기본

완충용액의 선택은 단백질 실험의 성패에 중요한 영향

 pH 개념, 용액상의 수소이온 농도 pH = -log[H+], (Sorensen)

pH = pKa + log [A-]/[HA], 즉 pH는 pKa + log [염]/[비해리 산]

강산이나 강염기가 가하여져도 pH가 쉽게 변하지 않는 용액 '완충용액'

이온계수 (ionic strength)

완충용액은 하나의 커다란 염 (salt)

염농도의 수준을 표시하는 것이 이온계수 (ionic strength)

이온계수(Γ/2)는 1/2ΣMiZi2

-Mi는 이온의 농도(molarity)

-Zi는 전하

*pH의 완충용액이라고 할지라도 인산 완충용액이 Tris 완충용액보다 높은 이온계수를 가져 이온교환수지 크로마토그래피에서 는 적절치 않음

표. 염의 유형에 따른 이온계수 

T.G. Cooper. (1977) The Tools of Biochemistry. N.Y.: John Wiley & Sons

염	유형	이온계수
KCl, NaB	1:1	M
CaCl2, Na2PO4	2:1	3 X M
MgSO4	2:2	4 X M
FeCl3, NaPO4	3:1	6 X M
Fe2(SO4)3	2:3	15 X M

대표적인 완충용액

Glycine buffer (pKa=2.35) 

낮은 pH 영역의 완충용액

protein A나 protein G 혹은 항원을 고정화시킨 담체를 사용하여 항체를 정제시 용울액으로 사용 (0.1〜0.2 M, Glycine-HCl, pH 3.0 또는 2.5)

용출시킨 후 곧 바로 중성 완충용액을 가하여 중성화시키는 것이 항원 활성에 유리

Acetate buffer (pKa=4.76) 

구연산(citric acid, pKa1, a2, a3 = 3.14, 4.77, 6.39)

숙신산(succinic acid, pKa1, a2 = 4.22, 5.64)

MOPS buffer (pKa=7.15)

낮은 이온계수와 높은 완충효과

Northern blot과 같은 특정한 상태에서 사용

 3-(N-mopholino) propanesulfonic acid가 주요 성분 (고가시약)

Phosphate buffer (pKa=7.22)  (많이 사용됨)

Na2HPO4와 NaH2PO4을 적절한 비율로 혼합 (저렴하다는 장점)

Ca2+, Mg2+ 등의 다가 양이온과 불용성의 복합체를 형성

인산의 영향을 받는 효소반응 존재

농도와 이온 조성의 변화에 의한 pH의 변동 폭이 큼

높은 이온계수를 지님

HEPES buffer (pKa=7.55) 

pKa가 생리적인 pH에 가깝고 세포독성이 낮음(조직배양용액)

N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid 주요 성분

Tris buffer (pKa=8.30) (많이 사용됨)

tris(hydroxymethyl) aminomethane가 주요 성분

Tris는 산성 쪽 pKa의 pH 7.5 부근까지는 이용이 가능

온도변화에 따라 pH의 변화가 있다는 것이 tris 완충용액의 단점

온도에 따라 pH의 변화가 심하므로 상온(20℃)에서 만들어 냉장보관 필요