[단백질] 단백질 정량법

*질문, 필요하신 정보 댓글이나 방명록에 남기시면 함께 고민해 보겠습니다.

단백질의 농도를 측정하는 방법은 다양하게 있으며, 생물학적제제 기준 및 시험법에는 마이크로킬달법, Lowry법, Biuret법을 설명하고 있다.
하지만... 단백질 정량법은 상황과 조건에 따라 다양한 방법을 이용 할 수 있다. DC protein assay kit도 있지만. 나중에 소개 하기로하고 이번에는 기초적인 개념만 잡는 것으로.

단백질의 정량법  절대적인 단백질의 농도를 측정하는 방법

종류
UV법, Lowry법, BCA법, Bradford법, 기타 간편한 dye-binding법 등

정량법 선택시 주의사항
단백질 종류에 의한 감도의 차이, 방해물질의 유무와 허용농도, 반응액의 pH 등에 따라 적절한 방법을 선택 필요

정량방법
표준물질, 완충용액(blank), 목적 단백질 용액을 차례로 측정하여 검량선으로부터 단백질 농도를 산출

UV법

단백질용액의 흡광도를 분광광도계(spectrophotometer)로 측정
타이로신과 트립토판에서 발생하는 잔기의 방향족에 기초하여 280 nm부근의 홉광도
측정범위는 0.1〜1 mg/mL
간편하게 측정이 가능하고 시료 또한 회수가 가능한 장점
보유된 타이로 신과 트립토판의 비율과 입체구조 내에서의 노출정도 차이로 정밀한 단백질 정량으로 보기힘듬
단백질의 정제과정이나 일련의 실험과정에서 간접적인 농도 파악용
BSA의 경우 A280(1 mg/mL) = 0.7

A=abc, c=A/ab의 Beer-Lambert 공식
(A는 흡광도, a는 흡광 상수, b는 광로장 1 cm, c는 농도)


Lowry법
Biuret을 더 발전시킨 방법
단백질용액을 알칼리성 조건하에서 먼저 Cu2+와 반응시킨 다음 folin 시약을 첨가
Cu+에 의해 phosphate molybdenum acid(인몰리브덴산)-tungsten acid complex가 환원되어 파랗게 발색
측정 범위 0.2〜2 mg/mL 
방해물질 (계면활성제 EDTA 등의 chelate제나 DTT와 2-mercaptoethanol 등의 환원제)


BCA법

Lowry법을 계량한 것
folin 시약의 반응 대신 bicinchoninate(BCA)가 Cu+와 복합체를 형성해 자주색으로 발색하는 반응
Lowry법과 비교하면 방해물질 중 계면활성제의 영향을 받지않음
측정 범위 0.1〜1 mg/mL
신뢰성, 직선성 등이 모두 좋은 방법
단백질의 종류에 따른 발색의 차이적음
반응액이 알칼리성이기 때문에 지질을 함유하고 있는 시료 또한 알칼리성에서 가용화되어 그대로 측정이 가능


Bradford법
coomassie brilliant blue G-250이라고 하는 색소가 단백질의 염기성과 방향족 아미노산 잔기와 결합
흡광도가 465 nm부터 595 nm로 이동하는 것을 이용하는 방법
간단, 신속, 고감도
측정 범위 0.02~01 mg/mL
환원제와 EDTA의 영향을 거의 받지 않음. 계면활성제의 영향받음
반응액이 산성이므로 지질을 대량으로 함유하는 시료에서는 침전을 생성