[프로토콜]gDNA분리, Isolation of Genomic DNA from Bacterial cell

*질문, 필요하신 정보 댓글이나 방명록에 남기시면 함께 고민해 보겠습니다.

세균 (Bacterial cell)에서 Genomic DNA 추출(분리) (gDNA Isolation) 방법과 주요 개념에 대해 알아보자.
(사실... membrane 타입의 kit가 잘나와있다.)

실험전 사용시약에 MSDS (material safety data sheet) 확인하고 취급정보 및 주의사항 등 안전을 확보하고 실험해야한다.

실험방법
1. 실험용 세균을 준비한다. (Bacterial cell culture) 
    ex)E.coli OD600 2~3
2. 1.5mL 배양액을 튜브에 담고 원심분리기 (centrifuge) 를 이용하여 펠렛 (pellet)과 상등액 (supernatant)을 분리한다. 
    ex) 6000 rpm, 5 min 원심분리
3. 분리한 상등액 (supernatant)를 제거하고 펠렛 (pellet)을 TE (Tris EDTA) 570uL 를 이용하여 재부유 (resuspend)한다.
4.  30uL 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) 와 3uL 20mg/mL proteinase-K 넣어주고 섞어준다음 1시간 동안 37'C에서 인큐베이팅한다.
5. 반응이 완료되면 100uL 5M NaCl을 넣고 섞어준다. (NaCl 농도가 0.5M보다 작으면 Nucleic acid가  침전될수 있음,  석출이 되면 80uL NaCl solution을 추가로 넣는다.)
6. 24:1(chloroform / isoamyl alcohol)혼합액 0.7~0.8 mL 을 넣어주고 섞어준다. 이후 원심분리기를 이용하여 6000 rpm, 5min 원심분리하고 상등액 (Supernatant)을 새로운 튜브에 옮겨 담는다.
7. 25:24:1 (phenol / chloroform / isoamyl alcohol)혼합액일 0.7~0.8mL 넣고 섞어주고 6000 rpm, 5min 원심분리하고 상등액 (Supernatant)을 새로운 튜브에 옮겨 담는다.
8. 상등액 (Supernatant)에  isopropanol 0.4~0.5mL를 넣고 흰색의 DNA 침전물이 생길때 까지 조심히 섞어준다. 10000 rpm, 10 min, RT (room temperature) 에서 원심분리하고 상등액 (Supernatant)을 제거한다. 펠렛(pellet)에 100uL 70% 에탄올을 넣는다.
9. RT (room temperature)에서 5min 원심분리하고 에탄올을 완전히 증발시켜 펠렛을 건조 (dry pellet) 한다.
10. 건조한 펠렛을 50uL TE buffer를 넣어 놓인다. (일반적으로 5~20 ug DNA/mL 추출됨, 10^8~10^9 cells/mL)
11. 아가로우즈 젤 전기영동 (agarose gel electrophoresis)또는 나노드랍 (nano drup)을 이용하여 DNA의 순도 (purity)를 확인 한다. 추출한 DNA는 4'C에 보관한다.


*추출한 DNA의 정량(quantity) 및 정성(quality) 을 확인하기 위해
agarose gel electrophoresis 또는 ultra-violet (UV)- visible spectrophotometer를 사용할 수 있다.

Optical density 260nm (OD260)에서 1.0 은 아래와 같다.
1. dsDNA (double-stranded DNA) 50 ug/mL
2. ssDNA (single-stranded DNA) 33ug/mL
3. oligonucleotide 20~30ug/mL
4. RNA 40 ug/mL


각 시약의 역활

Tris-EDTA buffer
  50mM Tris와 50mM Ethylenedinitrilo tetra-acetic acid (EDTA) 혼합액, pH8.0
  Tris는 pH를 조절하는 pH buffer역활
  EDTA 양이온 킬레이팅 (Mg+2)
  DNA를 용해시키고 degratation 되지 않게 보호하는데 도움을 주는 역활

Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)
  10% SDS genomic DNA를 분리하는 역활
  강한 음이온 (anionic) detergent, 세포벽 (membrane)을 깨트리고 chromosome에서 DNA를 자유롭게함

Proteinase-K
  대부분의 종류의 단백질 불순물 (protein impurities)를 degradation 하는 효소 (enzyme)

NaCl solution
  Na+가 DNA의 phosphates (-)전하를 막는 역활
  
Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol
  단백질, 지질과 결합함
  단백질을 denaturing하는데 효과적임

Isopropanol
  DNA는 isopropanol에서 거의 녹지 않음 (highly insoluble)


Troubleshootings
  1. RNA contamination
    bacteria cells이 너무 많은 경우
    RNase 를 넣어주지 않은 경우
  2. Protein contamination
    bacteria cells이 너무 많은 경우
  3. DNA concentration is to less
    bacteria cells이 너무 적은 경우
  4. Insoluble pellet after DNA precipitation
  5. Degraded DNA