[미생물]실험에 필요한 기본 지식_현미경 관찰

*질문, 필요하신 정보 댓글이나 방명록에 남기시면 함께 고민해 보겠습니다.

1. 현미경 관찰

세균 표본은  일반적으로 잘 보이지 않으므로 염색액으로 염색하거나, 암시야조사법, 위상차현미경을 쓰기도 함

세균의 운동을 검사할 때는 홈이 파진 슬라이드글라스를 사용하고, 커버글라스를 덮고 현적표본검사를 함

유침법의 원리

유침법을 사용하는 이유는 세균을 높은 배율 (1000배)로 하지 않고는 보이지 않으므로 렌즈가 작아지고 시야가 어두워지기 때문

슬라이드글라스의 굴절률과 같은 굴절률의 cedar 오일을 슬라이드글라스와 렌즈 사이에 넣으면 굴절 없이 모든 빛이 대물렌즈 안에 모이게 됨

2. Gram 염색

1884년 크리스티앙 그람 (Chistian Gram)이 최초로 개발

4가지 시약, 염기성 염료 (crystal violet 또는 methyl violet), 매염제 (iodine), 탈색제 (알코올, 에세톤 또는 이들의 혼합액), 대조 염색제 (safranin 또는 carbolfuchsin)

Gram 양성균은 crystal violet 염료로 염색한 후 탈색제 처리로 탈색되지 않기 때문에 염색 후 남색이나 보라색을 나타냄

Gram 음성균은 매염제의 처리 후에도 탈색제에 의해 탈색되기 때문 나중에 염색하는 대조 염색액에 의해 염색되어 발간색으로 관찰됨

2.1. Gram 염색 방법

1) 도말, 고정시킨 슬라이드에 crystal violet을 가하여 1분간 염색한다.

2) 물로 서서히 염색액을 씻어 낸다.

3) 매염제인 iodine 용액을 가하여 1분가 처리한다.

4) iodine을 물로 씻어낸다.

5) 30초간 95% 알코올로 탈색시킨다.

6) 물로 알코올을 씻어낸다.

7) safranin 으로 45초 동안 대조 염색한다.

8) 물로 safranin을 씻어낸다.

9) 여분의 수분을 말린 후 검경한다.

*Gram 음성균이라도 도말한 시료층이 두껍거나 탈색이 불완전하게 이루어진 경우에는 양성균으로 판별될 수있음

Gram 양성균의 경우에는 탈색을 심하게 하였을 때, 음성균으로 잘못 판정할 수 있음

정지기 (stationary phase) 이후 늙은 세포는 Gram 음성균으로 잘못 판정하기 쉽기 때문에 대수기 (log phase) 초반의 세균을 얇게 도말하여 염색하고, 대조군으로 양성, 음성 판별이 확실한 균을 사용하여 비교

3. 항산성 염색

항산성을 나타내는 이유는 이들 세균이 마이콜산 (mycolic acid)이라는 지질을 다량 함유하기 때문

Mycobacteria나 Actinomycetes등이 항산성 세균으로 이러한 균은 일반적인 염색법으로 잘 염색되지 않음

항산성인 Mycobacterium속 세균은 열을 가해야만 염색이 가능, 염색된 후에는 산성 알코올 등의 탈색제로도 탈색이 되지 않기 때문에 붉은 색으로 관찰

항산성이 없는 세균은 탁색 후 methylene blue나 1% malachite green등으로 대조 염색

3.1. 항산성 염색 방법

1) 균주를 슬라이드 위에 도말하고 열 고정한다.

2) Carbol fuchsin 염색액으로 3~5분간 가온 염색한다. 김이 날 정도로 가온하며, 증발하여 마르지 않도록 염색액을 가끔 보충 시킨다. 너무 가열하여 슬라이드가 깨지지 않도록 주의한다.

3) 실온으로 슬라이드를 식힌 후, 흐르는 물로 세척한다.

4) 3% HCl-알코올 로 10~30초간 탈색한 후, 흐르는 물로 씻는다.

5) Loeffler's alkaline methyene blue로 20~30초간 대조 염색한다.

6) 물로 세척한 후 물기를 말리고 검경한다.

*항산성균은 붉은색, 비항산성균은 청색으로 염색

생균이나 객담 (가래) 등의 가검물에서 질병에 감염될 우려가 있으므로 오염되지 않도록 세심한 주의를 해야함

4. 협막 염색

많은 종류의 세균은 세포벽 외부에 협막 또는 피막(capsule)이 존재

이 구조의 크기는 세균의 종류나 배양 배지의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 협막의 성분은 다당류, 폴리펩티드 또는 당단백질로 되어있음

병원성 세균인 경우, 협막이 발달되어 있으면 병원성이 강함

4.1. 협막 염색 방법

1) 슬라이드 한쪽 끝에 먹물이나 nigrosin 용액을 한 방울 떨어 뜨린다.

2) 백금이로 균을 한 방울 취하여, 염색약과 섞는다.

3) 한 손으로 염색액과 균액이 놓인 슬라이드를 잡고, 다른 손으로 깨끗한 슬라이드의 끝을 염색액과 균액이 있는 부분에 댄 후, 염색액과 균액을 슬라이드 전면에 도말 시키기 위해 민다.

4) 도말 표본을 공기 중에서 건조시킨 후 유침 검경한다.

5. 편모 염색

편모는 균체에 비해 길이가 길고 매우 가늘어서 일반적인 염색법으로는 관찰 할수 없음

편모를 염색하는 것은 가는 편모에 작은 입자를 다수 부착시켜 광학현미경으로  관찰 할수 있게 하는 방법

타닌산 (tannic acid), 콜로이드성 매염제가 편모 표면에 집적되어 두께가 증가

편모는 균체에 비해 난염색성이고, 염색 과정중 편모가 탈락하기 쉬워 특수 염색법 중 어려움

5.1. 편모 염색 방법

1) 액체배지에서 자란 균액에 0.25ml의 37% Formaldehyde 용액을 넣고 잘 흔들어 혼합후 15분간 고정한다.

2) 시험관 위에서 1cm 아래 까지 증류수로 채운 후 혼합한 다음, 3분 동안  원심분리하여 균을 침전시킨다.

3) 상층액을 조심스럽게 따라 버린후, 다시 증류수를 가하여 혼합하고 원심분리시킨다.

4) 다시 상층액을 따라 버리고 2ml 정도의 증류수를 가한다.

5) 이와 같이 처리한 균액을 한 배금이 떠서 슬라이드에 떨어뜨린 후 슬라이드를 기울게 하여 균액이 슬라이드에 잘 퍼질 수 있도록 한다. (강하게 도말하면 펴모가 떨어질수 있음0

6) 공기 중에서 건조하고 Leifson 용액을 도말 부위에 떨어뜨리고 염색액의 알코올 성분이 증발할 때 까지 염색한다. (완전히 염색되면 염색액 표면에 금속성 과택이 남)

7) 흐르는 물로 가볍게 세척한 후 건조시키고 유침 검경한다.